Sitotoksisite canlı bir hücredeki toksik etki oranı manasına gelmektedir. Bu oranın anlaşılması hususunda bir takım testler uygulanmaktadır. Nitekim hücrede var olan çoğalma oranı ve hücre içerisindeki toksik etkisi ölçülerek değerlendirilen testlere sitotoksisite testleri denir.
Bu testler 3 ana başlık altında toplanmıştırlar.
Tetrazolyum Tuzları Yardımı ile Yapılmakta Olan Testler: Tetrazolyum tuzları, heterosiklik organik yapıda olan bileşiklere verilen isimdir. Keşfedildiği senelerden günümüz zamanına kadar 1000’i aşkın üyesi ile sentezlenmiş ve tanımlanmıştır (Altman, 1976). Tetrazolyum tuzlarının elektron alarak indirgenmeleriyle beraber , formazan adı verilen yapıya dönüşmelerin yardımcı olarak , renk değişikliğini de beraber olarak getirir. Renk reaksiyonları yalnızca canlı hücrelerde rastlanmaktadır. Tetrazolyum testleri toplamda üç aşamada yaşanmaktadır. Birinci aşamada canlı hücreler belli oranda toksik maddeye maruz bırakılırlar. İkinci aşamada ise toksik madde birbirinen uzaklaştırılıp tetrazolyum bileşiği eklenerek 1-4 saat boyunca inkübe edilir. En son aşamalarda ise renk değişimi spektrofotometrik yöntem ile ölçülüp canlı ya da ölü hücre sayısının belirlenmesi gerçekleşir.
LDH Enzim Salı Verilmesi Testi: Hücre canlılığının analizinde kullanılmakta olan diğer bir yöntem ise hasarlı ya da ölü hücrelerden vasata salınmış olan laktat dehidrojenaz (LDH) faalietinin belirlenme durumudur. (Decker ve Lohmann-Matthes, 1988; Korzeniewski ve Callewaert, 1983). Laktat dehidrojenaz, bütün hücrelerde rastlanan sitoplazmik bir enzim olarak bilinir. Hücreler, toksik etkilere maruz bırakıldığı takdirde plazma membran bütünlükleri bozularak LDH enzimi hücrelerden sızıp vasata geçiş sağlar. Böylece maruziyet sonrasında LDH enzim faaliyetinin ölçümü ile hasar değerlendirmesi gerçekleşir.
Lüminesans Metodlar:
Alamar Mavisi Floresans Testi ve Diğer Floresans Metodlar: Alamar mavisi testinde, Erb ve Ehlers (1950) kişileri tarafından, biyolojik sıvı ve süt maddelerinde bakteriyel kontaminasyonun belirlenmesi nedeniyle ilk defa 1950 yıllarında kullanılmış, daha sonrasında ise Ahmed ve ark. (1994), bu testleri radyoaktif [3 H]timidin birleşme testine bir yan seçenek olarak uyarlamıştır. Bu yöntem, alamar mavisi (resazurin) ismi verilen bileşiğin, canlı hücreler ile beraber resorufin bileşiğine dönüşmesi durumuna dayanmaktadır. Resazurin, oksidatif şeklinde bulunan mavi renkte bir redoks boyası olarak bilinir, hücre zarından serbest bir şekilde geçerek hücreye giriş sağlar ve burada indirgenip floresans özelliği olan pembe renkteki resorufin bileşiğine dönüşümü gerçekleşir. Ölü hücreler, metabolik aktivitelerini kaybetmesinden ötürü resazurini indirgeyemez ve floresans sinyali oluşturma yetisi bulunmaz. Oluşmakta olan sinyal, florometre kullanımı ile tespit edilir ve canlı hücre sayısı artış gösterdikçe sinyal şiddetlenir.
ATP Biyolüminesans Testi: Adenozin trifosfat (ATP) molekkürleri, biyolojik sistemler ile enerji kaynağı şeklinde görevini gerçekleştirir ve metabolik bir şekilde aktif tüm hücrelerde bulunabilir. (Crouch ve ark., 1993). Hücre ölümünü takipte, hücrenin ATP sentez durumu kaybolur ve endojen ATPazlar hazır ATP’yi hızlı bir şekilde yıkımı gerçekleştirir. Bu sebepten ötürü intrasellüler ATP içeriğinde, hücre canlılığının temel göstergesi şeklinde nitelenmiştir ve canlılık belirlenmesi yöntemleri arasındaki yerini almaya başlamıştır. ATP biyolüminesans testi, multipleytlerde yapılmakta olan canlılık testleri arasında en hızlı, en hassas ve en kolay yöntem olarak tanımlanmıştır (Lomakina ve ark., 2015; Riss ve ark., 2006).
Gerçek Zamanlı (Real Time) Biyolüminesans Testi: Canlılık testlerinin büyük çoğunluğu, hücreleri yok edilmiş ya da daha ileri incelenmesine izin verilmeyen son test (end-point) formatı şeklinde ve bu da toksik maddenin kinetik ve gerçek zamanında analizini imkânsız hale getirmiştir. Toksisite, zaman ve doza bağlı olmasından ötürü, farklı doz aralıklarının etkileri sadece farklı zamanlar içinde incelenerek anlaşılabilir. ATP biyolüminesans testine benzemekte olan şekilde bu testte de lusiferaz enzimi kullanılmıştır.. Fakat bu testte kullanılmış olan lusiferaz enzimi, farklı bir canlıdan elde edilmiştir. Lusiferaz prosubstratı olaraksa koelenterazin adı verilen bir madde kullanılır.
Sitotoksisite testleri için laboratuvarımız EUROLAB ile çalışabilirsiniz.